上科大物質(zhì)學院季泉江課題組與合作者開發(fā)細菌靶向遺傳篩選新方法

靶向遺傳篩選是揭示細菌基因型-表型之間聯(lián)系和研究細菌復雜調(diào)控網(wǎng)絡機制的關(guān)鍵技術(shù)。然而，目前細菌中常用的靶向遺傳篩選方法，例如MAGE（多重自動基因組改造）和TRMR（可追蹤多元重組工程），高度依賴于特殊的重組酶，只能適用于十分有限的物種中，缺乏普適性�；�于CRISPR-Cas9/Cas12a（一種基因編輯工具）的靶向遺傳篩選系統(tǒng)，通過利用基因組非同源末端連接修復機制，能夠在真核細胞中實現(xiàn)高效的靶向遺傳失活篩選。然而，多數(shù)細菌中缺乏高效的非同源末端連接修復機制，因而CRISPR-Cas9/Cas12a不能應用于細菌中靶向遺傳失活篩選。因此，亟需在細菌中開發(fā)普適性的靶向遺傳篩選系統(tǒng)。

近日，上海科技大學的季泉江課題組與中山大學的駱觀正課題組合作，在Cell Reports發(fā)表了題為“Targeted genetic screening in bacteria with a Cas12k-guided transposase”的文章，報道了名為Site-specific Transposon-Assisted Genome Engineering （STAGE，定點轉(zhuǎn)座基因組改造）的靶向遺傳篩選新方法。該方法通過整合高通量DNA合成、CRISPR-Cas12k引導的轉(zhuǎn)座酶和雙重篩選策略實現(xiàn)細菌中普適性的靶向遺傳篩選，將促進細菌基因組進化和細菌功能基因組學等研究。

CRISPR-Cas12k引導的轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)（ShCAST）是一種由Cas12k、gRNA、TniQ/TnsBC轉(zhuǎn)座酶構(gòu)成的定向轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。利用Cas12k/gRNA復合物的基因組識別和定位功能，TniQ/TnsBC能夠“移花接木”一般將一段外源DNA序列插入到細菌基因組的特定位點，實現(xiàn)對細菌基因組的定向轉(zhuǎn)座。研究人員成功地將ShCAST系統(tǒng)應用于銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌的基因組定向轉(zhuǎn)座，并通過引入抗生素和蔗糖的雙重篩選策略，高效富集了正確轉(zhuǎn)座的突變菌株，從而利于后續(xù)大規(guī)模靶向轉(zhuǎn)座文庫構(gòu)建。

圖| 細菌中STAGE文庫構(gòu)建策略與系統(tǒng)評價

由于STAGE系統(tǒng)只需要改變gRNA上的靶向spacer序列，就能實現(xiàn)對不同位點的轉(zhuǎn)座，因此適用于細菌大規(guī)模靶向轉(zhuǎn)座文庫的構(gòu)建。通過DNA高通量合成，研究人員構(gòu)建了針對銅綠假單胞菌所有轉(zhuǎn)錄因子的細菌突變文庫，并進一步通過定量擴增子測序策略，評估了構(gòu)建的菌株庫的質(zhì)量。測序結(jié)果顯示98.5%的靶基因都成功發(fā)生了轉(zhuǎn)座，驗證了該系統(tǒng)可以有效應用于細菌大規(guī)模靶向文庫構(gòu)建。

利用銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)錄因子的突變文庫，研究人員篩選了銅綠假單胞菌抗生素耐藥性的基因和相關(guān)通路。通過對藥物處理前后不同gRNA介導的插入事件數(shù)量的統(tǒng)計，研究人員分別鑒定到了不同的耐藥/敏感基因。為了驗證從STAGE文庫中鑒定出的基因在抗生素耐藥性中的作用，研究人員使用基于CRISPR-Cas9的基因組編輯技術(shù)重建了可信的突變體，藥物篩選的結(jié)果與STAGE突變文庫鑒定的結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)表明STAGE方法是一種有效且可靠的工具，可用于基因型-表型關(guān)系的高通量分析。

研究證實，STAGE是一種使用Cas12k引導的轉(zhuǎn)座酶在不同微生物物種中進行高通量位點特異性基因組工程的全新方法。除基因定點失活外，STAGE還可用于將功能基因組元件高通量地整合到不同微生物物種的目標基因組位點中，這是以往依賴同源重組或隨機轉(zhuǎn)座子誘變的方法難以實現(xiàn)的。此外STAGE方法也可用于混合細菌群落中的多重基因破壞和物種特異性遺傳操作。

上�？萍即髮W物質(zhì)學院副研究員陳未中和中山大學博士生任澤慧為本文的共同第一作者，上海科技大學季泉江教授和中山大學駱觀正教授為本文的共同通訊作者，上海科技大學為論文第一完成單位。該工作得到國家自然科學基金、科技部重點研發(fā)計劃、上海市自然科學基金、廣東省自然科學基金、廣州實驗室應急項目的支持。

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https://www.網(wǎng)址未加載/science/article/pii/

S2211124721010780

圖 文 季泉江

排 版 張麗敏

編 輯 陳 蕾

高 瑄

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